更新更新時間:2008-03-18
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HPLC分析是系統(tǒng)的工作,每個環(huán)節(jié)都很重要;看似簡單的環(huán)節(jié),反而容易疏忽,引起整個實驗的結(jié)果偏差,因此養(yǎng)成良好的習(xí)慣是很重要的。色譜柱是色譜系統(tǒng)的心臟,液相色譜柱的正確安裝與使用,是色譜工作的關(guān)鍵;也是獲得正確可靠的實驗數(shù)據(jù)的必經(jīng)之路。
一·液相色譜柱的安裝
1 液相色譜柱的結(jié)構(gòu):
a.空柱由柱接頭柱管及濾片組裝而成
柱接頭采用低死體積結(jié)構(gòu),柱接頭是兩端螺紋組件,一端是為7/16英才外螺紋,另一端是3/16英才的內(nèi)螺紋(國內(nèi)外已規(guī)范化)。7/16英才外螺紋與1/4英寸柱管(¢
在兩端柱接頭內(nèi),柱管兩端各放置一片不銹鋼濾片(或濾網(wǎng)),用于封堵柱填料不被流動相沖出柱外流失??罩鹘M件均為316#不銹鋼材質(zhì),能耐受一般的溶劑作用。但含氯化物的溶劑對其有一定的腐蝕性,故使用時要注意,柱及連接管內(nèi)不能長時間存留此類溶劑,以避免腐蝕。
b. 柱填料:
液相色譜柱的分離作用是在填料和流動相之間進行的,柱子的分類是根據(jù)填料類型而定。
正相柱:多以硅膠為填料。根據(jù)外型可分為無定型和球型兩種,其顆粒直徑在3-10um的范圍內(nèi)。另一類正相填料是硅膠表面鍵合—CN,—NH2等官能團即所謂的鍵合相硅膠。
反相柱:主要是以硅膠為基質(zhì),在其表面鍵合十八烷基官能團(ODS)的非極性填料。也有無定型和球型之分。常用的其他反相填料還有鍵合C8,C4,C2,苯基等,其顆粒直徑在3-10um之間。
2 色譜柱的安裝
a. 拆開柱包裝盒,確認色譜柱的類型,尺寸,出廠日期以及柱內(nèi)儲存的溶劑。
b. 擰下柱兩端的密封堵頭放回包裝盒備用。
c. 按柱管上標(biāo)示的流動相流向,將色譜柱的入口端通過連接管與進樣閥出口連接(如條件允許,建議在柱前使用保護柱);柱的出口與檢測器連接。連接管是外徑為
二·液相色譜柱的使用:
色譜柱在使用前,進行的柱的性能測試,并將結(jié)果保存起來,作為今后評價柱性能變化的參考。但要注意:柱性能可能由于所使用的樣品、流動相、柱溫等條件的差異而有所不同;另外做柱性能測試時是按照色譜柱出廠報告中的條件進行(出廠測試所使用的條件是*條件),只要這樣測試的結(jié)果才有可比性。
1 樣品的前處理:
a. 使用流動相溶解樣品。
b. 使用預(yù)處理柱除去樣品中的強極性或與柱填料產(chǎn)生不可逆吸附的雜質(zhì)。
c. 使用0.45um的過濾膜除去微粒雜質(zhì)。
2 流動相的配置:
液相色譜是樣品組分在柱填料與流動相之間質(zhì)量交換而達到分離的目的,因此要求流動相具備以下的特點:
a. 流動相對樣品具有一定的溶解能力,保證樣品組分不會沉淀在柱中(或長時間保留在柱中)。
b. 流動相具有一定的惰性,與樣品不產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)(特殊情況除外)。
c. 流動相的黏度要盡量的小,以便在使用較長的分析柱時能得到好的分離效果;同時降低柱壓降,延長液壓泵的使用壽命(可運行提高溫度的方法降低流動相的黏度)。
d. 流動相的化學(xué)性質(zhì)要與使用的檢測器相適應(yīng)。如用UV檢測器,使用對紫外吸收較低的溶劑配制。
e. 流動相的沸點不要太低,負責(zé)容易產(chǎn)生氣泡,導(dǎo)致實驗無法進行。
f. 在流動相配置好后,一定進行脫氣。除去溶解在流動相中的微量氣體既有利于檢測,還可以防止流動相中的微量氧與樣品發(fā)生作用。
3 流動相流速的選擇:
因柱效是柱中流動相線性流速的函數(shù),使用不同的流速可得到不同的柱效。對于一根特定的色譜柱,要追求*柱效,使用*流速。對內(nèi)徑為
當(dāng)選用*流速時,分析時間可能延長??刹捎酶淖兞鲃酉嗟南礈鞆姸鹊姆椒ㄒ钥s短分析時間(如反相柱時,可適當(dāng)增加甲醇或乙腈的含量)。
注意:
1).由于甲醇的廉價,對于反相柱推薦使用甲醇體系(必須使用乙腈的除外)。
2).對于正相柱推薦使用沸程為30
3).含水流動相在實驗前配制,尤其是夏天使用緩沖溶液作為流動相不要過夜。加入*,防止細菌的生長。
4).流動相要求使用0.45um濾膜過濾,除去微粒雜質(zhì)。
5).使用HPLC級溶劑配置流動相,使用合適的流動相可延長色譜柱的使用壽命,提高柱性能。
4 柱性能的測試:
——啟動液相色譜儀:a. 流動相流速設(shè)定為1ml/min。
b.UV檢測器波長設(shè)定為254nm。
——使用出廠測試時使用的流動相組成及測試樣品。
——記錄并計算測試結(jié)果。